（3）病毒感染剂量的确定：测定HIV的感染剂量一般采用在96孔细胞培养板上微量培养滴定的方法，通过观察细胞病变或检测病毒标记物，如HIV p24抗原或逆转录酶等，计算出病毒的感染性滴度（半数组织培养感染剂量，50% Tissue culture infectious dose， TCID50）。在不同的细胞系/病毒株培养系统，使用的病毒感染剂量不尽相同，一般选用100～1000TCID50。
2、药物的细胞毒性测定：将不同浓度的药物加入细胞培养板中，在特定条件下培养一定时间，用适宜的方法测定活细胞的比例，计算药物对细胞的毒性（半数细胞毒性浓度，Median toxic concentration，TC50）。
3、抗HIV活性测定：
（1）试验分组
空白对照组：正常培养的细胞。
阳性对照组：阳性对照药与病毒和细胞共同培养。阳性对照药一般选择与受试药物作用靶点相同的临床有效药物。
阴性对照组：药物溶媒与病毒和细胞共同培养。
病毒对照组：病毒和细胞共同培养。
药物对照组：受试药物与细胞共同培养。
试验组：受试药物与病毒和细胞共同培养。
（2）感染和给药方法：一般采用药物、病毒、细胞同时培养的方式，也可以根据药物作用的靶点采取药物先与HIV作用再加细胞、药物先与细胞作用再加HIV或HIV先感染细胞再加药物的感染和给药方式。
（3）监测指标和方法：
细胞病变：在显微镜下观察细胞的形态，观察有无HIV特征性的细胞病变（合胞体以及细胞融合）。
HIV抗原：用ELISA方法检测培养上清液中的HIV p24 抗原浓度。
逆转录酶：用同位素掺入或其他方法检测培养上清液的逆转录酶活性。
根据细胞病变观察、p24抗原或逆转录酶检测的结果，计算药物对病毒的抑制活性（半数抑制浓度，Median inhibition concentration， IC50）。
4、药效学评价指标
由于病毒的存活与复制依赖于宿主细胞，而抗病毒药物本身有一定的细胞毒性，因此不能仅以细胞病变、p24抗原或逆转录酶活性作为药效学评价的指标，而应以治疗指数（TI）为主要的评价指标。一般认为治疗指数大于10的药物可能具有体外抗HIV活性。
5、药物的联合抗HIV活性测定
将2～3种不同的药物加入到同一实验体系中，按照前述的方法监测病毒的抑制情况，判断药物对病毒的联合作用。实验中除了设置一般体外药效学研究需要的对照以外，还应有各单药对照。联合抗HIV活性测定的数据分析方法比较复杂，需采用特定的模型和软件。
二、体内药效学试验
1、SIV感染猴模型
（1） 病毒：SIV毒株，静脉注射或粘膜感染。
（2） 动物：恒河猴、食蟹猴等，体重5公斤左右，动物数应满足评价的要求，一般每组4～6只。
（3） 病毒感染剂量的测定：可采用两种方法，一种方法是用保存的毒种在体外感染猴淋巴细胞，初步确定病毒的感染剂量。一般选择三个剂量组，每组间10倍稀释，每个稀释度接种两只猴，感染后不同时间取血，通过细胞培养测定病毒滴度，并定量检测SIV RNA，以两只猴均感染的最小剂量作为最小感染量（Monkey infectious dose，MID100）。另一种方法是用感染猴的血浆接种猴，感染后每周取血测定SIV抗原和细胞培养病毒，计算半数感染量（Median infectious dose， ID50）。
（4） SIV感染猴治疗试验：
急性感染治疗试验：猴静脉注射10～100ID50 或5MID100 的SIV，同时或4小时后口服或注射最大无毒剂量以下2倍递减2个剂量的药物，每天给药，连续8周。每周取血，培养病毒，测定SIV p27抗原滴度和SIV RNA，计算保护百分率，并与病毒对照组进行比较。给药前、停药当天和停药后8周进行淋巴结检查，观察免疫系统的病理改变。另外，还要测定CD4＋、CD8＋细胞数和CD4＋/ CD8＋比值。
慢性感染治疗试验：猴静脉注射10～100ID50或5～10MID100 的SIV，感染后60天左右开始给药，一般试验组在最大无毒剂量以下2倍递减2个剂量。每天给药，连续8周。于给药前、给药第8周、停药当天和停药后8周取血，测定SIV p27抗原滴度和SIV RNA，计算保护百分率，并与病毒对照组进行比较。给药前、停药当天、停药后8周进行淋巴结检查，观察免疫系统的病理改变。另外，还要测定CD4＋、CD8＋细胞数和CD4＋/ CD8＋比值。
2、HIV感染SCID-hu小鼠模型
（1）动物：SCID小鼠，4～8周龄，雌性，静脉注射人PBMC或移植人胚胸腺/肝脏组织。
（2） HIV感染剂量测定：将HIV细胞培养上清液10倍连续稀释5个浓度，静脉注射或移植组织注射感染小鼠。1周后取小鼠的血液、脾、淋巴结和腹腔洗液，定量培养，测定病毒滴度，HIV p24抗原、病毒载量，计算ID50。
（3）药物毒性测定：SCID-hu小鼠灌服或静脉注射给药，测定急性毒性和亚急性毒性，计算半数致死量（Median lethal dose， LD50）和最大耐受量（0% Lethal dose， LD0）。
（4）HIV感染SCID-hu小鼠药物治疗试验：SCID-hu小鼠腹腔注射10～100ID50 HIV，2～24小时后灌服或静脉注射给药。感染1周后，取血液、脾、淋巴结和腹腔洗液，定量培养，测定病毒滴度，HIV p24抗原、病毒载量，计算抑制率和半数有效剂量（Median effective dose， ED50），并与病毒感染对照组进行比较。
附录二：
耐药性研究的相关问题
考察药物对HIV耐药性毒株是否有抗病毒活性，至少应该评价对相同作用靶点的耐药性毒株的抗病毒活性，所选用的耐药性毒株应该经过全面的鉴定。由于抗HIV药物已经有很多种，交叉耐药性是临床上的一个重要问题，因此应关注药物对于相同作用靶点有耐药性的病毒的抗病毒活性，及已上市药物对受试药物诱导的耐药毒株的抗病毒活性。耐药毒株的试验结果可提示药物用于该类耐药株的临床有效性。
考察药物是否容易导致病毒产生耐药性以及耐药性毒株的生物学特性，可在体外进行耐药毒株的诱导试验，以确定药物是否容易导致病毒产生耐药性以及耐药性毒株的基因型和表型特征，并检验交叉耐药性。
有些药物的遗传阈值比较低，病毒基因发生1～2个点突变就可产生耐药性，而有些药物的遗传阈值比较高，需要多个基因位点的突变才能产生耐药性。可采用两种方法诱导药物的耐药毒株：（1）病毒在固定的药物浓度下连续传代，可使用多个不同药物浓度的培养系统，这种方法对于遗传阈值低的药物比较有效；（2）病毒在逐渐增加药物浓度的情况下连续传代培养，药物浓度从IC50值的一半起始，监测病毒复制的情况并诱导出耐药毒株。
用基因型和表型方法对诱导出的耐药毒株进行鉴定。基因型分析可以确定哪些基因突变导致HIV对药物的敏感性下降，主要方法是对HIV基因组中药物作用的靶基因进行核酸序列测定，并与野生毒株的靶基因序列进行比较。对传代过程中不同代次的毒株进行序列测定可确定多个突变出现的先后顺序。表型耐药性分析能够确定突变的病毒是否对药物的敏感性下降以及下降的程度。耐药性相关基因突变的确定有助于使用重组病毒系统评估这些突变导致的表型耐药性，也就是使用定点诱变系统或PCR方法扩增病毒基因组相应的部分引入这些特定的突变，以便检测重组病毒在体外对药物的敏感性；也可以采用在含有不同浓度药物的培养基中培养的方法，通过测定HIV抗原、HIV RNA、HIV逆转录酶、细胞毒性或报告基因的表达等确定IC50值并与参考毒株的IC50进行比较，以IC50增加的倍数作为衡量表型耐药性的指标。
附录三：
名词解释
半数组织培养感染剂量（50%Tissue culture infectious dose ，TCID50）：是使50%细胞感染的病毒稀释度。
半数有效量（Median effective dose）：是能引起50%阳性反应或50%最大效应的浓度或剂量，分别用半数有效浓度（EC50）、半数抑制浓度（IC50）或半数有效剂量（ED50）表示。如果效应指标为毒性或死亡，则可改为半数毒性浓度（TC50）、半数毒性剂量（TD50）或半数致死浓度（LC50）、半数致死剂量（LD50）表示。
治疗指数（Therapeutic index， TI）：药物诱导细胞死亡的效力与抑制病毒复制的效力的比值（50%细胞毒性浓度/50%有效抑制浓度，TC50/IC50），
半数致死量（Median lethal dose， LD50）：在一定试验条件下引起50%动物死亡的剂量。
最大耐受量（0% Lethal dose， LD0）：不引起受试动物死亡的最高剂量。
附件二：
手性药物质量控制研究技术指导原则
一、概述
三维结构的物体所具有的与其镜像的平面形状完全一致，但在三维空间中不能完全重叠的性质，正如人的左右手之间的关系，称之为手性。具有手性的化合物即称为手性化合物。手性是自然界的一种基本属性，组成生物体的很多基本结构单元都具有手性，如组成蛋白质的手性氨基酸除少数例外，大都是L-氨基酸；组成多糖和核酸的天然单糖也大都是D构型。作为调节人类的相关生命活动而起到治疗作用的药物，如果在参与体内生理过程时涉及到手性分子或手性环境，则不同的立体异构体所产生的生物活性就可能不同。手性化合物除了通常所说的含手性中心的化合物外，还包括含有手性轴、手性平面、手性螺旋等因素的化合物。在本指导原则中所指的手性药物主要是指含手性中心的药物，其它类型的手性药物也可参考本指导原则的基本要求。
手性药物是指分子结构中含有手性中心（也叫不对称中心）的药物，它包括单一的立体异构体、两个以上（含两个）立体异构体的不等量的混合物以及外消旋体。不同构型的立体异构体的生物活性也可能不同，大致可分为以下几种情况【1】：
1）药物的生物活性完全或主要由其中的一个对映体产生。如S-萘普生在体外试验的镇痛作用比其R异构体强35倍。
2） 两个对映体具有完全相反的生物活性。如新型苯哌啶类镇痛药-哌西那朵的右旋异构体为阿片受体的激动剂，而其左旋体则为阿片受体的拮抗剂。
3） 一个对映体有严重的毒副作用。如驱虫药四咪唑的呕吐副作用是由其右旋体产生的。
4） 两个对映体的生物活性不同，但合并用药有利。如降压药-萘必洛尔的右旋体为β-受体阻滞剂，而左旋体能降低外周血管的阻力，并对心脏有保护作用；抗高血压药物茚达立酮【2】的R异构体具有利尿作用，但有增加血中尿酸的副作用，而S异构体却有促进尿酸排泄的作用，可有效降低R异构体的副作用，两者合用有利。进一步的研究表明，S与R异构体的比例为1：4或1：8时治疗效果最好。
5） 两个对映体具有完全相同的生物活性【3】。如普罗帕酮的两个对映体都具有相同的抗心率失常作用。
正是由于手性药物的不同立体异构体在药效、药代及毒理等方面都可能存在差异，美国FDA在其关于开发立体异构体新药的政策【4】中要求在对手性药物进行药理毒理研究时，应分别获得该药物的各立体异构体，进行必要的比较研究，以确定拟进一步开发的药物。所以手性药物药学研究的主要任务就是为药物的筛选与进一步研究提供足够数量与纯度的立体异构体。本指导原则是在一般化学药物药学指导原则的基础上，并充分考虑手性药物的特殊性而起草的，其目的是为手性药物的药学研究提供一般性的指导。本指导原则中所说的手性药物主要针对单一的立体异构体、两个以上（含两个）立体异构体组成的不等量混合物。
